PCR 实验室通风空调设计参考

一、PCR实验室概述
PCR 即聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。其基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，是在模板 DNA、引物和 4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，该技术可以将极微量的靶DNA 特异地扩增上百万倍，从而在短时间内获得所需的大量特定基因片段，因此能在临床上检测单分子 DNA或每 10 万个细胞中仅含 1 个靶 DNA 分子的样品。
二、PCR 实验室平面布局
根据《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》规定，临床基因扩增检验实验室需要设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区等四个区域。如使用全自动分析仪，区域设置可以适当合并。虽然 PCR 实验室的四个功能分区是固定的，但各医院在实际布置中却千差万别，其主要布置形式有分散式和集中式两种。
分散式：各实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。各实验之间不易相互干扰。
集中式：完成 PCR 四个实验过程的实验用房相邻布置，形成集中、独立的实验区域。每个实验室应设置独立缓冲间、实验室间应设置带消毒装置的传递窗。
在理想情况下，PCR 实验室缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。若房间进深允许，可设 PCR 内部专用走廊。在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。试剂和标本通过机械连锁传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染，达到人、物分流。
三、PCR 实验室的主要功能和设备配置
1. 试剂储存和准备区
该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
2. 标本制备区
该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸 (RNA、DNA) 提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA 的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。
3. 扩增反应混合物配制和扩增区
该区域主要进行的操作为DNA或cDNA 扩增。此外，已制备的 DNA 模板和合成的 cDNA( 来自样本制备区 ) 的加入和主反应混合液 ( 来自试剂贮存和制备区 ) 制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式 PCR 测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。
四、PCR 实验室空调通风设计
1. 设计依据
国际上，世界卫生组织（WHO）一直非常重视实验室生物安全问题，早在 1983 年就出版了《实验室生物安全手册》，2003年4月第二版 ( 修订版 ) 以电子版形式在 WHO 网页上问世。美国在实验室的生物安全管理方面更是走在了世界的前列，NIH/CDC 联合出版的《微生物学及生物医学实验室生物安全准则》现已推出了第四版。很多国家在制定本国的生物安全准则时，主要参考上述两个标准。我国关于 PCR 实验室建设及管理的现行技术规范和标准有以下几种：
《临床基因扩增检验实验室工作规范》
《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发【2010】194 号
《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
《生物安全实验室建筑技术规范》 GB50346-2011
《实验室生物安全通用要求》GB19489-2008
《洁净厂房设计规范》GB50073—2013
《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》WS233-2002 中华人民共和国卫生部
  实验室规范《JGJ91 科学实验室建筑设计规范》等
2. 设计参数
根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》：对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。典型的二级生物安全水平实验室（图片由CUH2A，Princeton, NJ, USA 提供）。根据《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011 中，生物安全实验室分级。根据实验室所处理对象的生物危害程度和采取的防护措施，生物安全实验室分为四级。微生物生物安全实验室二级可采用BSL-2 表示。

 
根据《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011生物安全实验室二级屏障的主要技术指标：
  
根据《临床基因扩增（PCR）检验实验室规范》中对于房间正负压的要求：标本制备区：可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。扩增区：可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。扩增产物分析区：采用负压条件或减压情况下 ( 如安装排风扇 ) 可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。
另外，根据《JGJ91 科学实验室建筑设计规范》：
噪声要求：通用实验室、学术活动室允许噪声级不宜大于55dB(A 声级 )；研究工作室、阅览室允许噪声级不应大于 50dB(A 声级 )。采暖空调温、湿度要求：采暖地区通用实验室的冬季采暖室内计算温度应为 18~20℃。通用实验室的夏季空气调节室内计算参数为：温度26~28℃，相对湿度小于 65%。
总结各规范标准与实际使用需求，以下是空调通风室内设计参数总结表：通过工艺平面设计，使 PCR 实验室具有合理的功能布局，以符合生物安全规范中洁污分流和防止交叉感染等方面的要求；同时通过对送入室内的新风量和排出室外的排风量进行控制，使室内按照设计要求建立相应的压力梯度，防止污染物的进入或扩散；采取过滤或杀菌消毒措施有效去除空气中会影响实验结果的微生物和尘埃等；采取合理的气流组织，保证室内气流均匀、减少死角，并保证全面通风时的气流组织与生物安全柜等局部排风装置运行时的气流组织相协调。
3. 空调设计
空调负荷主要有以下几部分构成：围护结构负荷、人员负荷（一般少于常规房间）、照明负荷、设备负荷（包含生物安全柜、冰箱、离心机、灭菌锅、冻干机等设备）、新风负荷（最大组成部分）。
采取的空调形式可以有两种：
1）全空气系统
设置全空气空调系统时，采取以下措施：
初效 +中效 +高效的三级过滤；
空调风机变频，选用运行曲线陡降型；
对于设置生物安全柜的房间设置变风量新风系统；全面排风与生物安全柜排风分开设置。
2）净化风机盘管 + 变风量新风系统
设置净化风机盘管 + 变风量新风系统时，采取以下措施：
净化风机盘管送、回风口采用低阻高中效过滤器，超低阻高中效过滤器对大气菌的过滤效率达到 95%；
新风系统根据房间内生物安全柜的运行情况变频运行；
全面排风与生物安全柜排风分开设置。
4. 通风过滤与气流组织设计
1）通风系统：全面通风：换气次数≥6次/ 小时；送风采用新风机组经热、湿处理及三级（初效+中效+亚高效）过滤后送入室内；排风口设置于房间的下部，且在排风口设置高效过滤器；新风机组和排风机均采用变频机组，以应对工况的改变。
局部排风：生物安全柜，柜口面风速≥ 0.5m/s；采用Ⅱ级 B2 型生物安全柜；生物安全柜排风系统单独设置，高空排放，且在排风入口设置高效过滤器，室外排风口高于所在建筑物屋面2m 以上；多台生物安全柜并联运行时应采用变风量排风系统，其新风补风系统也应变风量运行。
2）过滤：英国伦敦公共卫生中心实验室 Nobel 的测定结果显示，空气中某些病毒和细菌的单体气溶胶等效中值直径为7.7~17.2μm 之间。因此，PCR 实验室末端过滤器采用亚高效过滤器（粒径≥ 0. 5μm，99.9>η>95，额定风量下的初阻力≤ 120Pa，效率为大气尘计数效率）满足使用要求。
3）气流组织：为避免交叉污染，PCR 实验室空气流向必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区进行。
此外，还需遵循以下原则：气流组织采用上送下排，送风口和排风口布置应使室内气流停滞的空间降低到最小程度。在生物安全柜操作面或其他有气溶胶操作地点的上方附近不得设送风口。单向布置，不应有障碍。高效过滤器排风口应设在室内被污染风险最高的区域。
5. 压差控制
PCR 实验室压差控制方案：
风量和排风量：缝隙法计算实验室及缓冲间保持一定压力时所需要的送风计算公式：

其中 △P—压差（Pa）
Ρ —空气密度，取 1.2kg/m³
V—流量，m3/h
A—根据缝隙宽度计算的泄漏面积㎡
μ—常数，取0.72
由以上公式可知，在实验室内排风量确定的情况下，通过调节进入实验室的送风量可以维持房间和参照区域恒定的压差。此计算风量可以作为设计的依据，由此来对新风机组、排风机组及附属的风管、风口等进行选型和计算。但是在实际操作中，施工安装的门、窗的结构形式及气密性等参数可能会与设计院选用的设计值有偏差；实验室长期运行后维护结构的气密性和缝隙的宽度也会发生一定的变化，这些因素都会对原缝隙法计算的结果造成影响，进而使室内的压力梯度变化，严重时影响实验室的实验结果，特别是人员进出房间开、关门时的漏风，会迅速破坏室内的压力梯度。
由于以上问题的存在，再进行 PCR 实验室个房间压差控制时，除了通过缝隙法计算基础风量外，还通过安装压差控制器，测量实验室、缓冲间与参照区域间的实际压差，和设定值进行比较，根据控制器的PID运算得出偏差值，以此为信号控制送风阀的动作，进而对房间送风量及送 / 排风量差进行调节，从而最终控制房间的压差值。这种控制需要系统中的变风量调节阀实现闭环控制，同时需要送、排风阀的执行机构有快速的反应能力。根据实验证明，控制生物安全柜排风的变风量调节阀响应时间小于1S且实验室内通风系统的风量平衡相应时间小于3S时，生物安全柜调节窗位置改变不会引起柜内气体外溢的现象发生。

为了防止实验室开 / 关门窗引起室内与缓冲间、缓冲间与专用走道间出现压差为0时送风系统变风量风阀开度很小甚至关闭的情况发生，PCR 实验室送风变风量阀应预设风量偏移限制，以避免特殊情况发生导致大面值泄漏时出现送风量过小的现象发生。
五、参考文献
1.《民用建筑供暖通风与空气调节设计规范》GB50736-2012
2.《生物安全实验室建筑技术规范》 GB50346-2011
3.《临床基因扩增检验实验室工作规范》
4.《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发【2010】194 号
5.《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
6.《实验室生物安全通用要求》GB19489-2008
7.《洁净厂房设计规范》GB50073—2013
8.《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》WS233-2002 中华人民共和国卫生部
9.《JGJ91 科学实验室建筑设计规范》
10.《高效空气过滤器》GB13554-2008
11.《实验室生物安全手册》第四版