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PCR实验室，你了解吗？
2022-03-29 浏览次数：194
PCR实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。就新冠病毒核酸检测来，RT-PCR是目前使用最广泛和较准确的筛选和确认方法。
一、PCR实验室的核心难题
实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕同一个核心问题进行——“避免污染”，任何级别的医院在建设PCR实验室时，均需要提前考量各个因素，以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。
1.建设要求。PCR实验室的建设需要设置标准的“四区”：试剂准备区、标本制备区、PCR扩增检测区和扩增产物检测区。每个独立实验区设置有缓冲区，各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并降低扩增产物对人员和环境的污染。
2.人员要求。进入PCR实验室，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取PCR上岗证。
3.检测风险。检测过程中，样本的开盖，核酸提取的震荡、离心都有可能生气溶胶，有感染的风险。
4.防护要求。必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进入。
二、PCR实验的污染来源都有哪些？
1.样本间交叉感染：收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。
2.实验试剂污染：主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃，但这个过程也充满污染风险。
3.扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4.克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。
三、防止实验污染有哪些措施？
1.正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。
2.正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。
3.核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。
4.重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。
5.PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。
6.实验室随手可及的消毒剂。
四、PCR实验室的空气流向与环境消毒
PCR实验室可分为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物检测区四个区域，这四个区域在物理空间上必须完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。所以，临床基因扩增检验实验室的空气流向应按：试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区，应时刻防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域。可按照上述顺序区域空气压力递减的方式进行，也可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行方式实现。
临床基因扩增检验实验室的环境清洁：《临床基因扩增实验室工作规范》中有对物表清洁、消毒的要求，不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
1.基本原则：由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。
2.清洁消毒方向：准备区→标本制备区→扩增区→产物检测区。
3.清洁消毒范围：工作区域的物体表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒剂擦拭消毒，空气和工作台面可使用紫外线照射消毒，也可使用空间消毒器进行全环节消毒。
4.不可使用紫外线消毒器及化学消毒进行有人状态下的消毒。
5.PCR室内的消毒应防止扬尘（减少人员走动）、杀灭DNA或RNA的基因片段。可选择悬挂紫外线灯管进行空气消毒，试验前照射30-60分钟，实验结束照射30-60分钟，必要时延长照射时间（可照射一夜）。
6.终末消毒：当出现实验室污染时，应按要求立即撤出相关人员，在无人情况下可使用化学消毒剂进行终末消毒，如熏蒸法：过氧乙酸1g/ m³加热熏蒸（湿度70-90%），密闭24小时；气溶胶喷雾：3%过氧化氢：20mL/m³气溶胶喷雾；5%过氧乙酸2.5mL/m³气溶胶喷雾（湿度20-40%）。
五、日常清洁消毒应该如何做？
1.每日工作前后，对工作区域表面、地面进行清洁并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清洁采用湿式、不扬尘的方式进行。
2.物品防尘存放。墙面定期清洁，有可见污染及时进行清洁消毒。
3.配备移动紫外线消毒装置进行空气和物表的消毒。
4.生物安全柜的消毒：
a.每天工作前：对生物安全柜的内表面进行消毒，包括工作台面和内壁使用消毒剂擦拭。
b.工作结束：柜内物品全部消毒后移出。消毒剂擦拭台面四周、以及玻璃内侧灯部位。
c.消毒剂应选择能够杀死生物安全柜里可能发生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒剂）。在使用漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还应用无菌水再次进行擦拭。
d.停用生物安全柜前，运行5min以净化内部空气。
e.终末消毒：需要进行终末消毒的时机：生物安全。
六、试验完成后，物品及环境如何处理？
1.做好废液及固废处理。
2.实验室空间消毒：在室温，50-60%湿度条件下，使用过氧乙酸熏蒸2g/m³，过夜；或使用20g/l气溶胶喷雾，用量8g/m³。
3.物体表面消毒液：0.55%含氯消毒剂，现用现配，24小时内使用。
